Laporan Praktikum Kimia Organik - Analisis Kualitatif Protein

BAB IV

ANALISIS KUALITATIF PROTEIN

TUJUAN       :

• Mengetahui prinsip dasar uji kualitatif protein
• Mengetahui perbedaan prinsip dari masing-masing metode

A. Pre-lab

1. Bagaimana prinsip analisis protein dengan metode ninhidrin? Uji Ninhidrin dilakukan dengan menambahkan beberapa tetes larutan ninhidrin yang kemudian dipanaskan. Reaksi ini terjadi dengan senyawa amin primer dan ammonia tanpa pembebasan CO. Adanya protein atau asam amino ditunjukkan dengan terbentuknya warna ungu pada bahan uji (Hidayatullah, 2012).

2. Bagaimana prinsip analisis protein dengan metode biuret? Pembentukan kompleks Cu2+ dengan gugus –CO dan –NH dari rantai peptida dalam suasana basa. Uji ini untuk menunjukkan adanya senyawa-senyawa yang mengandung gugus amida asam yang berada bersama gugus amida yang lain. Uji ini memberikan reaksi positif yaitu ditandai dengan timbulnya warna merah violet atau biru violet (Hidayatullah, 2012).

3. Mengapa pengujian protein selalu dilakukan pada kondisi alkali/basa? Sebenarnya protein bersifat amfoter, bisa bereaksi dengan asam atau basa. Namun lebih mudah bereaksi dengan suasana basa, selain itu agar mudah untuk diamati. Dalam uji biuret, supaya ion Cu2+ dari pereaksi biuret (dalam suasana basa) akan bereaksi dengan polipeptida atau ikatan- ikatan peptida yang menyusun protein membentuk senyawa kompleks berwarna ungu atau violet (Hidayatullah, 2011).

Tinjauan Pustaka

1.      Protein

Protein tersusun dari peptida-peptida sehingga membentuk suatu polimer yang disebut polipeptida. Setiap monomernya tersusun atas asam amino. Peranan protein diantaranya sebagai katalisator, pendukung, cadangan, sistem imun, dsb.

Hampir semua asam amino, kecuali glisin mempunyai atom karbon kiral. Asam amino kiral memiliki dua bentuk isomeri. Memiliki kemiripan sifat fisika dan kimia, kecuali kemampuan membedakan arah putar bidang polarisasi.

Protein yang tersusun dari rantai asam amino akan memiliki berbagai macam struktur yang khas pada masing-masing protein. Adapun struktur protein meliputi struktur primer, struktur sekunder, struktur tersier, dan struktur kuartener. Struktur primer merupakan struktur yang urutan asam aminonya tersusun secara linear dan tidak terjadi percabangan rantai. Struktur sekunder merupakan kombinasi antara struktur primer yang linear dan memiliki segmen-segmen dalam polipeptida yang terlilit. Struktur tersier dari suatu protein adalah lapisan yang tumpang tindih di atas pola struktur sekunder yang terdiri atas pemutarbalikan tak beraturan dari ikatan antara rantai samping (gugus R) berbagai asam amino Struktur kuarterner adalah protein membentuk molekul kompleks, beberapa rantai protein bergabung membentuk seperti bola (Carey, 2006).

Gambar 1. Struktur umum asam amino (Anonim, 2012).

Gambar 2. Level dari struktur protein (Anonim, 2012).

2.      Metode Pengujian Kualitatif Protein

2.1   Metode Biuret
Uji biuret merupakan uji umum untuk mengetahui ikatan peptida dalam suatu protein. Larutan protein dibuat alkalis dengan NaOH kemudian ditambahkan larutan CuSO₄ encer. Uji ini memberikan reaksi positif yaitu ditandai dengan timbulnya warna merah violet atau biru violet (Azhar, 2010).

2.2   Pereaksi Xantoprotein

Larutan asam nitrat ditambahkan ke dalam larutan protein secara hati-hati. Setelah dicampurkan akan terbentuk endapan putih yang dapat berubah menjadi kuning bila dipanaskan. Uji ini positif untuk protein yang mengandung asam amino tirosin, fenilalanin, dan triptofan (Azhar, 2010).

2.3   Reaksi Millon
Pereaksi Millon adalah larutan merkuro dan merkuri nitrat dalam asam nitrat. Apabila pereaksi ini ditambahkan pada larutan protein, akan menghasilkan endapan putih yang dapat berubah menjadi merah oleh pemanasan. Reaksi ini positif untuk fenol-fenol, karena terbentuknya senyawa merkuri dengan gugus hidroksifenil (Azhar, 2010).

2.4   Reaksi Ninhidrin
Ninhidrin adalah suatu senyawa oksidator kuat yang apabila bereaksi dengan asam α amino akan menghasilkan warna ungu. Reaksi ini terjadi dengan senyawa amin primer dan ammonia tanpa pembebasan CO. Reaksi ninhidrin digunakan untuk mengetahui adanya kandungan asam α-amino (Azhar, 2010).

2.5   Reaksi Sakaguchi
Pereaksi yang digunakan ialah naftol dan natriumhipobromit. Pada dasarnya reaksi ini memberikan hasil positif apabila ada gugus guanidin. Jadi arginin atau protein yang mengandung arginin dapat menghasilkan warna merah (Azhar, 2010).

3.      Reagen dan Fungsi

Ninhidrin adalah suatu reagen yang berguna untuk mendeteksi asam amino dan menetapkan konsentrasinya dalam larutan. Apabila bereaksi dengan asam amino menghasilkan zat berwarna ungu. Reagen ini dapat menyebabkan iritasi saluran pernafasan. Berbahaya jika tertelan dan berbahaya jika diserap melalui kulit atau terhirup. Biuret adalah reagen yang digunakan untuk mendeteksi adanya ikatan peptida. Dalam uji biuret ini terdapat 2 reagen, yakni CuSO₄ dan NaOH. Reagen-reagen ini dapat berbahaya jika tertelan, dapat menyebabkan gangguan pencernaan dan iritasi saluran pernafasan dengan luka bakar, menyebabkan iritasi mata dan kulit dan luka bakar, higroskopis, mutagen dan kemungkinan sensitizer (Tjahjadi, 2008).

4.      Tinjauan Bahan

4.1   Aquades

Merupakan bahan kimia yang tidak berbahaya bagi tubuh manusia karena memiliki pH netral sehingga tidak menimbulkan efek samping (Tejasari, 2005).

4.2   Telur

Telur mengandung protein hewani. Protein pada telur merupakan protein yang bermutu tinggi. Protein ini memiliki susuna asam amino yang lengkap dan sering dijadikan patokan dalam menentukan mutu protein dari berbagai bahan pangan lainnya (Tejasari, 2005).

4.3   Gelatin

Gelatin adalah protein yang diperoleh dari jaringan kolagen hewan. Pada umumnya diproduksi dari kulit dan tilang sapi atau babi. Gelatin digunakan pada industri makanan, farmasi, obat-obatan dan lain sebagainya (Tejasari, 2005).

4.4   Skim

Cairan susu yg telah dipisahkan dari kepala susu sehingga kadar lemak dan vitaminnya rendah (Tejasari, 2005).

4.5   Pemanis buatan rendah kalori

Merupakan zat kimia atau komponen alami yang menawarkan rasa manis gula dengan jumlah kalori yang lebih sedikit dari gula. Pemanis buatan, jauh lebih manis dibandingkan gula (Tejasari, 2005).

4.6   MSG

MSG adalah asam glutamat yang diproduksi dari fermentasi tetes tebu dan pati makanan. Banyak ahli berpendapat akumulasi MSG selama bertahun-tahun bisa memicu berbagai penyakit termasuk obesitas, alzheimer, dan penyakit kronis lainnya (Tejasari, 2005).

B. Diagram Alir

1. Uji Ninhidrin

 

2. Uji Biuret

C. Hasil Percobaan Dan Pengamatan :

1. Uji Ninhidrin

a. Tuliskan data hasil uji Ninhidrin

No.	Sampel	Sebelum Pemanasan	Setelah Pemanasan	Hasil Uji (+) / (-)
1.	MSG	Putih bening	Ungu pekat	+
2.	Aspartam	Putih	Bening, terbentuk endapan putih	-
3.	Gelatin	Bening kental	Bening	-
4.	Susu skim	Putih	Ungu pudar	+
5.	Putih telur	Kuning bening	Kuning bening	-

b. Bahas dan bandingkan data-data hasil uji Ninhidrin dari beberapa sampel dalam percobaan ini!

       Uji ninhidrin merupakan uji umum untuk protein yang spesifik untuk asam amino. Dalam percobaan kali ini menggunakan sampel MSG, aspartam, gelatin, susu skim dan putih telur. Dari data hasil praktikum di atas menunjukkan hasil yang berbeda-beda tiap sampel. Dengan percobaan ini dapat diketahui sampel mana yang positif mengandung protein dilihat dari ada atau tidaknya kandungan asam aminonya.

       Percobaan pertama diawali dengan sampel MSG. Mula-mula MSG dimasukkan pada tabung reaksi sebanyak 2 ml menggunakan pipet volume, selanjutnya aspartam dimasukkan pada tabung reaksi sebanyak 2 ml menggunakan pipet volume. Selanjutnya gelatin dimasukkan pada tabung reaksi sebanyak 2 ml menggunakan pipet tetes. selanjutnya susu skim dimasukkan pada tabung reaksi sebanyak 2 ml menggunakan pipet volume, dan yang terakhir putih telur dimasukkan pada tabung reaksi sebanyak 2 ml menggunakan pipet volume. Kemudian masing-masing sampel ditambahkan ninhidrin sebanyak 2 ml. Kemudian secara bersamaan ke-lima sampel tersebut dimasukkan dalam gelas beker yang berisi air mendidih selama 15-20 detik. Kemudian secara bersamaan pula ke-lima sampel diangkat dari gelas beker.  Selanjutnya diamati perubahan warna yang terjadi pada kelima sampel tersebut.

       Dari percobaan yang telah dilakukan terdapat perubahan warna pada beberapa sampel yang diuji. Pada sampel  MSG  yang semula berwarna putih bening setelah dipanaskan warnanya berubah menjadi ungu pekat. Pada sampel aspartam yang semula berwarna putih setelah dipanaskan warnanya berubah menjadi bening dan terbentuk endapan putih. Pada sampel gelatin yang semula berwarna bening dan kental setelah dipanaskan warnanya berubah menjadi bening. Pada sampel susu skim yang semula berwarna bening setelah dipanaskan warnanya berubah menjadi ungu pudar. Pada sampel putih telur tidak ada perubahan warna pada saat sebelum dan sesudah dipanaskan, yakni tetap berwarna kuning bening.

       Pada prinsip kerja uji ninhidrin ini, menguji ada atau tidaknya protein dalam suatu senyawa dengan penambahan reagen ninhidrin untuk mengetahui jumlah kadar asam amino bebas yang terkandung didalamnya, dimana asam amino bebas akan bereaksi dengan ninhidrin dan membentuk senyawa kompleks berwarna ungu. Sehingga, karena setelah dipanaskan warnanya berubah menjadi ungu maka pada sampel MSG dan susu skim positif mengandung asam amino. Sedangkan pada sampel yang lain yakni aspartam, gelatin dan putih telur hasilnya negatif karena setelah dipanaskan warnanya tidak berubah menjadi ungu atau pink. Hal ini dikarenakan mereka tidak memiliki asam amino bebas sehingga hasil uji reagen ninhidrinnya negatif. Pada aspartam seharusnya berwarna ungu karena terdiri dari ikatan asam aspartat dan fenil alanin, ketika dipanaskan kedua ikatan tersebut lepas dan menjadi asam amino bebas sehingga bisa diidentifikasi oleh ninhidrin (Hamid, 2007). Namun pada data hasil percobaan diatas, aspartam negatif tidak mengandung asam amino. Kesalahan dan ketidak tepatan hasil percobaan dengan literatur desebabkan antara lain karena terlalu lama didiamkan setelah ditambah ninhidrin dan air yang digunakan belum mendidih dengan sempurna

       Pada MSG dan susu skim, warna ungu yang ditimbulkan MSG lebih pekat daripada susu skim. Hal ini menandakan bahwa MSG lebih banyak mengandung asam amino daripada susu skim. Semakin pekat warna ungu yang ditimbulkan maka semakin banyak asam amino yang terkandung didalamnya (Hamid, 2007).

Reaksi yang terjadi pada uji ninhidrin ini adalah :

Pada reaksi diatas ninhidrin ditambah asam alfa amino menghasilkan ninhidrin tereduksi dan NH3, karbondioksida dan gugus aldehidnya lepas ke lingkungan. Kemudian ninhidrin tereduksi dan NH3 ditambah ninhidrin baru diproses secara kondensasi menghasilkan garam diketo-hydrihalide-diketo-hydramine yang menyebabkan warna ungu (Hart, 2005).

           

2. Uji Biuret

a. Tuliskan data hasil uji Biuret

No.	Sampel	Sebelum Pemanasan	Setelah Pemanasan	Hasil Uji (+) / (-)
1.	MSG	Putih bening	Putih bening	-
2.	Aspartam	Putih	Putih bening	-
3.	Gelatin	Bening kental	Permukaan ungu	+
4.	Susu skim	Putih	Permukaan ungu	+
5.	Putih telur	Kuning bening	Permukaan ungu	+

b. Bahas dan bandingkan data-data hasil uji Biuret dari beberapa sampel dalam percobaan ini!

       Uji biuret merupakan uji umum untuk protein yang spesifik untuk ikatan peptida. Dalam percobaan kali ini menggunakan sampel MSG, aspartam, gelatin, susu skim dan putih telur. Dari data hasil praktikum di atas menunjukkan hasil yang berbeda tiap sampel. Dengan percobaan ini dapat diketahui sampel mana yang positif mengandung protein dilihat dari ada atau tidaknya ikatan peptida.

       Percobaan pertama diawali dengan sampel  MSG. Mula-mula MSG dimasukkan kedalam tabung reaksi sebanyak 3 ml menggunakan pipet volume, kemudian ditambah reagen NaOH 1 ml kemudian dikocok, setelah itu ditambahkan 3 tetes reagen CuSO₄ menggunakan pipet tetes kemudian diamati perubahan warnanya. Sampel kedua yaitu aspartam, aspartam dimasukkan kedalam tabung reaksi sebanyak 3 ml menggunakan pipet volume, kemudian ditambah reagen  NaOH 1 ml kemudian dikocok, setelah  itu ditambahkan 3 tetes reagen CuSO₄ menggunakan pipet tetes kemudian diamati perubahan warnanya. Sampel ketiga yaitu gelatin, gelatin dimasukkan kedalam tabung reaksi sebanyak 3 ml menggunakan pipet tetes, kemudian ditambah reagen  NaOH 1 ml kemudian dikocok, setelah  itu ditambahkan 3 tetes reagen CuSO₄ menggunakan pipet tetes kemudian diamati perubahan warnanya. Sampel keempat yaitu susu skim, susu skim dimasukkan kedalam tabung reaksi sebanyak 3 ml menggunakan pipet volume, kemudian ditambah reagen  NaOH 1 ml kemudian dikocok, setelah  itu ditambahkan 3 tetes reagen CuSO₄ menggunakan pipet tetes kemudian diamati perubahan warnanya. Terakhir sampel kelima yaitu putih telur, putih telur dimasukkan kedalam tabung reaksi sebanyak 3 ml menggunakan pipet volume, kemudian ditambah reagen  NaOH 1 ml kemudian dikocok, setelah  itu ditambahkan 3 tetes reagen CuSO₄ menggunakan pipet tetes kemudian diamati perubahan warnanya.

       Pada data hasil percobaan tersebut, MSG tidak berubah warna dari sebelum dan setelah direaksikan, yakni putih bening. Aspartam juga demikian, tidak mengalami perubahan warna dari sebelum dan setelah direaksikan, yakni putih. Namun berbeda dengan gelatin, susu skim dan putih telur. Gelatin yang semula berwarna bening kental, susu skim yang semula berwarna putih dan putih telur yang semula berwarna kuning bening, setelah direaksikan dengan reagen ketiganya berubah menjadi warna ungu pudar.

       Pada prinsip kerja biuret, yaitu menguji ada atau tidak adanya protein dalam suatu senyawa dengan penambahan reagen NaOH dan CuSO₄ berdasarkan ada atau tidaknya ikatan peptida (ikatan peptida harus 2 atau lebih). Dimana ion Cu²⁺ (dari pereaksi biuret) dalam suasana basa akan bereaksi dengan polipeptida yang menyusun protein dan membentuk senyawa kompleks berwarna biru hingga ungu (Azhar, 2010). Pada data percobaan diatas, MSG dan aspartam hasil ujinya adalah negatif,  karena setelah direaksikan warnanya tidak berubah dan tidak membentuk warna ungu. Hal ini dikarenakan MSG tidak memiliki ikatan peptida, sedangkan aspartam hanya memiliki satu ikatan peptida (Hamid, 2007). Sedangkan pada gelatin, susu skim dan telur hasil ujinya adalah positif, karena setelah direaksikan dengan reagen pada permukaannya warnanya berubah menjadi ungu. Hal ini disebabkan karena ketiganya memiliki ikatan peptida lebih dari dua sehingga bisa diidentifikasi dalam uji biuret ini, dan hasil ujinya positif. Apabila warnanya ungu maka ikatan peptidanya panjang, apabila warnanya kemerahmudaan maka ikatan peptidanya pendek. Pada gelatin, susu skim dan putih telur sama-sama permukaannya berwarna ungu jadi ketiganya sama-sama memiliki ikatan peptida yang panjang (Hart, 2005). Reaksi yang terjadi pada uji biuret ini adalah :

                                                                                                            (Hart, 2003).

PERTANYAAN

1.      Bagaimana mengidentifikasi adanya gugus amino pada sampel dengan menggunakan uji Ninhidrin?

Dengan memasukkan reagen ninhidrin pada sampel, karena asam amino akan bereaksi dengan ninhidrin dan membentuk senyawa kompleks berwarna ungu. Sehingga indikasi adanya asam amino ditunjukkan oleh perubahan warna sampel pada saat sesudah direaksikan dan dipanaskan, yakni apabila ia mengandung asam amino makan akan berwarna ungu. Namun ada juga yang tanpa dipanaskan sudah menghasilkan warna ungu, misalnya MSG (Hamid, 2007).

2.      Bagaimana reaksi yang terjadi antara sampel dengan reagen pada uji Biuret?

Dalam uji biuret ini, sampel harus dalam suasana basa agar polipeptida sampel dapat bereaksi dengan Cu²⁺ dari biuret. Uji ini sendiri didasarkan pada reaksi pembentukan kompleks Cu²⁺ yang dihasilkan oleh CuSO₄, dengan gugus –CO dan –Na pada ikatan peptida dalam larutan bersuasana basa dan menghasilkan senyawa kompleks berwarna biru hingga ungu. Setelah direaksikan dengan sampel, warna yang terbentuk mudah pudar, hal ini dikarenakan ion Cu²⁺ mengikat 2 ikatan peptida dan jika lama dibiarkan ikatan tersebut semakin lemah (tidak stabil) sehingga itu yang menyebabkan warnanya jika dibiarkan lama akan memudar (Azhar, 2010).

KESIMPULAN

            Dari percobaan diatas, dapat disimpulkan bahwa prinsip dari uji ninhidrin adalah menguji ada atau tidaknya protein dalam suatu senyawa dengan penambahan reagen ninhidrin untuk mengetahui jumlah kadar asam amino bebas yang terkandung didalamnya, dimana asam amino bebas akan bereaksi dengan ninhidrin dan membentuk senyawa kompleks berwarna ungu, dimana asam amino mereduksi ninhidrin. Sedangkan prinsip dari uji biuret adalah menguji ada atau tidak adanya protein dalam suatu senyawa dengan penambahan reagen NaOH dan CuSO₄ berdasarkan ada atau tidaknya ikatan peptida (ikatan peptida harus lebih dari 2). Dimana ion Cu²⁺ (dari pereaksi biuret) dalam suasana basa akan bereaksi dengan polipeptida yang menyusun protein dan membentuk senyawa kompleks berwarna biru hingga ungu.

            Dari data hasil percobaan diatas dapat disimpulkan bahwa yang positif terhadap uji ninhidrin adalah MSG dan susu skim. Sedangkan yang negatif terhadap uji ninhidrin ini adalah aspartam, gelatin dan putih telur. Sebenarnya aspartam juga positif terhadap uji ini, penyebab kesalahan dalam hal ini antara lain human error, terlalu lamanya aspartam yang sudah ditambah NaOH dan CuSO₄ di diamkan dan air yang belum sempurna mendidih. Sedangkan sampel yang positif terhadap uji biuret adalah gelatin susu skim dan putih telur dan yang negatif terhadap uji ini adalah MSG dan aspartam.

SARAN

            Sebaiknya pada saat praktikum tepat waktu dan tidak molor. Penugasan dan pemberian materi serta format laporan dapat diterima praktikan dengan baik. Hendaknya praktikan menggunakan K3 dengan lengkap.